Ürünler
2019-nCoV için Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR Tespit kiti
Beklenen kullanım
Bu kit, boğaz sürüntüleri, nazofaringeal sürüntüler, bronkoalveoler lavaj sıvısı, balgam kullanılarak yeni koronavirüsün (2019-nCoV) kalitatif tespiti için kullanılır. Bu ürünün tespit sonucu yalnızca klinik referans içindir ve tek başına kullanılmamalıdır. klinik teşhis ve tedavi için kanıt.Hastanın klinik belirtileri ve diğer laboratuvar testleriyle birlikte durumun kapsamlı bir analizi önerilir.
Muayene prensibi
Kit, tek adımlı RT-PCR teknolojisine dayanmaktadır.Aslında, 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) ORF1ab ve N genleri, amplifikasyon hedef bölgeleri olarak seçildi.Numunelerde 2019 yeni tip koronavirüs RNA'sını tespit etmek için spesifik primerler ve flüoresan problar (N gen probları FAM ile ve ORF1ab probları HEX ile etiketlenmiştir) tasarlanmıştır.Kit ayrıca numune toplama, RNA ve PCR amplifikasyon sürecini izlemek ve böylece yanlış negatif sonuçları azaltmak için bir endojen dahili kontrol algılama sistemi (CY5 ile etiketlenmiş dahili kontrol gen probu) içerir.
Ana bileşenler
| Bileşenler | Hacim（48T/Kit) |
| RT-PCR reaksiyon solüsyonu | 96µl |
| nCOV primeri TaqMan prob karışımı（ORF1ab,N Geni,RnaseP Geni） | 864ul |
| Negatif kontrol | 1500ul |
| nCOV Pozitif kontrol（l ORF1ab N Gen） | 1500ul |
Kendi reaktifleri: RNA ekstraksiyonu veya saflaştırma reaktifleri.Negatif/pozitif kontrol: Pozitif kontrol, hedef fragmanı içeren RNA'dır, negatif kontrol ise nükleik asit içermeyen sudur.Kullanım sırasında ekstraksiyona katılmalı ve bulaşıcı olarak kabul edilmelidir.İlgili yönetmeliklere uygun olarak kullanılmalı ve imha edilmelidir.
Dahili referans geni, insan RnaseP genidir.
Saklama koşulları ve son kullanma tarihi
-20±5℃, 5 defadan fazla tekrarlanan dondurma ve çözme işlemlerinden kaçının, 6 ay geçerlidir.
Uygulanabilir enstrüman
FAM / HEX / CY5 ve diğer çok kanallı floresan PCR cihazı ile.
Numune gereksinimleri
1. Uygulanabilir numune türleri: boğaz sürüntüleri, nazofaringeal sürüntüler, bronkoalveoler lavaj sıvısı, balgam。
2.Örnek toplama (aseptik teknik)
Faringeal sürüntü: Bademcikleri ve faringeal arka duvarı aynı anda iki pamuklu çubukla silin, ardından sürüntü kafasını örnekleme solüsyonunu içeren bir test tüpüne daldırın
Balgam: Hastanın derin bir öksürüğü varsa, öksürmüş balgamı örnekleme solüsyonu içeren vidalı kapaklı bir test tüpünde toplayın;bronkoalveolar lavaj sıvısı: Tıp uzmanları tarafından numune alma.3. Numunelerin saklanması ve taşınması
Virüs izolasyonu ve RNA testi için numuneler mümkün olan en kısa sürede test edilmelidir.24 saat içinde tespit edilebilen numuneler 4°C'de saklanabilir;24 içinde tespit edilemeyenler
saat -70℃ veya altında saklanmalıdır (eğer -70℃ saklama koşulu yoksa, bunlar
geçici olarak -20°C buzdolabında saklanır).Numuneler taşıma sırasında tekrarlanan dondurma ve çözme işlemlerinden kaçınmalıdır.Numuneler alındıktan sonra mümkün olan en kısa sürede laboratuvara gönderilmelidir.Numunelerin uzun mesafelerde taşınması gerekiyorsa, kuru buzda saklama önerilir.
Test yöntemleri
1 Örnek işleme ve RNA ekstraksiyonu (örnek işleme alanı)
RNA ekstraksiyonu için 200μl sıvı numune alınması tavsiye edilir.İlgili ekstraksiyon adımları için ticari RNA ekstraksiyon kitlerinin talimatlarına bakın.Hem olumsuz hem olumsuz
bu kitteki kontroller ekstraksiyona dahil edildi.
2 PCR reaktifi hazırlama (reaktif hazırlama alanı)
2.1 Kitteki tüm bileşenleri çıkarın ve çözün ve oda sıcaklığında karıştırın.Kullanmadan önce birkaç saniye 8.000 rpm'de santrifüjleyin;gerekli reaktif miktarını hesaplayın ve reaksiyon sistemi aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi hazırlanır:
| Bileşenler | N porsiyon (25µl sistem) |
| nCOV primer TaqMan prob karışımı | 18 µl × N |
| RT-PCR reaksiyon solüsyonu | 2 µl × N |
| *N = test edilen numune sayısı + 1 (negatif kontrol) + 1 (nCOV)pozitif kontrol) | |
2.2 Bileşenleri iyice karıştırdıktan sonra, tüp duvarındaki tüm sıvının tüpün dibine düşmesi için kısa bir süre santrifüjleyin ve ardından 20 µl'lik amplifikasyon sistemini PCR tüpüne bölün.
3 Numune alma (numune hazırlama alanı)
Ekstraksiyondan sonra negatif ve pozitif kontrollerden 5μl ekleyin.Test edilecek numunenin RNA'sı PCR reaksiyon tüpüne eklenir.
Tüpü sıkıca kapatın ve amplifikasyon algılama alanına aktarmadan önce birkaç saniye 8.000 rpm'de santrifüjleyin.
4 PCR amplifikasyonu (güçlendirilmiş algılama alanı)
4.1 Reaksiyon tüpünü cihazın numune hücresine yerleştirin ve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
| sahne | Döngü sayı | Sıcaklık(°C) | Zaman | Toplamakalan |
| Tersitranskripsiyon | 1 | 42 | 10 dk | - |
| ön denatürasyonn | 1 | 95 | 1 dakika | - |
| Döngü | 45 | 95 | 15'ler | - |
| 60 | 30'lar | Veri toplama |
Cihaz algılama kanalı seçimi: Floresan sinyali için FAM、HEX、CY5 kanalını seçin.Referans floresan YOK için lütfen ROX'u seçmeyin.
5 Sonuç analizi (Ayar için lütfen her cihazın deneysel talimatlarına bakın)
Reaksiyondan sonra sonuçları kaydedin.Analizden sonra, görüntüye göre taban çizgisinin başlangıç değerini, bitiş değerini ve eşik değerini ayarlayın (kullanıcı gerçek duruma göre ayarlayabilir, başlangıç değeri 3~15 olarak ayarlanabilir, bitiş değeri şu şekilde ayarlanabilir: 5~20, ayarlama) logaritmik grafikte Pencerenin eşiğinde, eşik çizgisi logaritmik fazdadır ve negatif kontrolün amplifikasyon eğrisi düz bir çizgidir veya eşik çizgisinin altındadır).
6 Quauty kontrolü（Teste bir prosedür kontrolü dahildir） Negatif kontrol:FAM, HEX, CY5 algılama kanalları için belirgin amplifikasyon eğrisi yok
COV pozitif kontrol: FAM ve HEX algılama kanallarının bariz amplifikasyon eğrisi, Ct değeri≤32, ancak CY5 kanalının amplifikasyon eğrisi yok;
Yukarıdaki gereksinimler aynı deneyde aynı anda karşılanmalıdır;aksi halde deney geçersizdir ve tekrarlanması gerekir.
7 Sonuçların belirlenmesi.
7.1 Test örneğinin FAM ve HEX kanallarında amplifikasyon eğrisi veya Ct değeri > 40 yoksa ve CY5 kanalında amplifikasyon eğrisi varsa 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) olmadığına karar verilebilir. numunedeki RNA;
.2 Test örneğinin FAM ve HEX kanallarında bariz amplifikasyon eğrileri varsa ve Ct değeri ≤40 ise, örneğin 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) için pozitif olduğu yargısına varılabilir.
7.3 Test örneğinin yalnızca bir FAM veya HEX kanalında net bir amplifikasyon eğrisi varsa ve Ct değeri ≤40 ise ve diğer kanalda amplifikasyon eğrisi yoksa, sonuçların yeniden test edilmesi gerekir.Yeniden test sonuçları tutarlıysa, numunenin yeni için pozitif olduğu yargısına varılabilir.
koronavirüs 2019 (2019-nCoV).Yeniden test sonucu negatif ise örneğin 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) için negatif olduğu yargısına varılabilir.
Olumlu yargı değeri
Kitin referans CT değerini belirlemek için ROC eğrisi yöntemi kullanılır ve dahili kontrol referans değeri 40'tır.
Test sonuçlarının yorumlanması
1. Her deney, negatif ve pozitif kontroller için test edilmelidir.Test sonuçları, yalnızca kontroller kalite kontrol gerekliliklerini karşıladığında belirlenebilir
2.FAM ve HEX algılama kanalları pozitif olduğunda, sistem rekabeti nedeniyle CY5 kanalından (dahili kontrol kanalı) alınan sonuç negatif olabilir.
3. Dahili kontrol sonucu negatif olduğunda, test tüpünün FAM ve HEX algılama kanalları da negatifse, sistem devre dışıdır veya işlem yanlıştır, test geçersizdir.Bu nedenle, numunelerin yeniden test edilmesi gerekir.
