Ürünler
2019-nCoV için Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR Tespit kiti
Beklenen kullanım
Bu kit, boğaz sürüntüleri, nazofaringeal sürüntüler, bronkoalveolar lavaj sıvısı, balgam kullanılarak yeni koronavirüsün (2019-nCoV) kalitatif tespiti için kullanılır. Bu ürünün tespit sonucu yalnızca klinik referans amaçlıdır ve klinik tanı ve tedavi için tek kanıt olarak kullanılmamalıdır. Hastanın klinik belirtileri ve diğer laboratuvar testleri ile birlikte durumun kapsamlı bir analizi önerilir.
Denetim ilkesi
Kit, tek adımlı RT-PCR teknolojisine dayanmaktadır. Aslında, 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) ORF1ab ve N genleri amplifikasyon hedef bölgeleri olarak seçilmiştir. Spesifik primerler ve floresan problar (N gen probları FAM ile etiketlenmiştir ve ORF1ab probları HEX ile etiketlenmiştir) örneklerde 2019 yeni tip koronavirüs RNA'sını tespit etmek için tasarlanmıştır. Kit ayrıca, örnek toplama, RNA ve PCR amplifikasyon sürecini izlemek için endojen bir dahili kontrol tespit sistemi (CY5 ile etiketlenmiş dahili kontrol gen probu) içerir ve böylece yanlış negatif sonuçları azaltır.
Ana bileşenler
| Bileşenler | Hacim（48T/Kit） |
| RT-PCR reaksiyon çözeltisi | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan prob karışımı (ORF1ab, N Geni, RnaseP Geni) | 864 µl |
| Negatif kontrol | 1500 µl |
| nCOV Pozitif kontrol（l ORF1ab N Geni） | 1500 µl |
Kendi reaktifleri: RNA ekstraksiyonu veya saflaştırma reaktifleri. Negatif/pozitif kontrol: Pozitif kontrol, hedef parçacığı içeren RNA'dır, negatif kontrol ise nükleik asitsiz sudur. Kullanım sırasında, ekstraksiyona katılmalı ve bulaşıcı olarak kabul edilmelidir. İlgili düzenlemelere uygun şekilde işlenmeli ve atılmalıdır.
İç referans geni insan RnaseP genidir.
Saklama koşulları ve son kullanma tarihi
-20±5℃, 5 kereden fazla tekrarlanan dondurma ve çözme işleminden kaçının, 6 ay geçerlidir.
Uygulanabilir enstrüman
FAM / HEX / CY5 ve diğer çok kanallı floresan PCR cihazları ile.
Numune gereksinimleri
1.Uygulanabilir numune tipleri: boğaz sürüntüleri, nazofaringeal sürüntüler, bronkoalveolar lavaj sıvısı, balgam.
2.Numune toplama (aseptik teknik)
Farenks sürüntüsü: Bademcikleri ve arka faringeal duvarı aynı anda iki sürüntü çubuğuyla silin, ardından sürüntü çubuğunun başını örnekleme solüsyonu içeren bir test tüpüne daldırın.
Balgam: Hasta derin bir öksürük geçirdikten sonra, öksürük balgamını örnekleme solüsyonu içeren vidalı kapaklı bir test tüpüne toplayın; bronkoalveolar lavaj sıvısı: Tıbbi uzmanlar tarafından örnekleme. 3.Numunelerin saklanması ve taşınması
Virüs izolasyonu ve RNA testi için numuneler mümkün olan en kısa sürede test edilmelidir. 24 saat içinde tespit edilebilen numuneler 4℃'de saklanabilir; 24 saat içinde tespit edilemeyenler
saatlerce -70℃ veya altında saklanmalıdır (-70℃'de saklama koşulu yoksa,
geçici olarak -20℃ buzdolabında saklanır). Numunelerin nakliye sırasında tekrar tekrar dondurulup çözülmesinden kaçınılmalıdır. Numuneler toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede laboratuvara gönderilmelidir. Numunelerin uzun mesafelerde taşınması gerekiyorsa, kuru buzda saklanması önerilir.
Test Yöntemleri
1 Örnek işleme ve RNA ekstraksiyonu (örnek işleme alanı)
RNA ekstraksiyonu için 200 μl sıvı örnek alınması önerilir. İlgili ekstraksiyon adımları için ticari RNA ekstraksiyon kitlerinin talimatlarına bakın. Hem negatif hem de negatif
Bu kitte bulunan kontroller ekstraksiyonda yer aldı.
2 PCR reaktif hazırlama (reaktif hazırlama alanı)
2.1 Kit içerisindeki tüm bileşenleri çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün ve karıştırın. Kullanmadan önce birkaç saniye 8.000 rpm'de santrifüj edin; gerekli reaktif miktarını hesaplayın ve reaksiyon sistemi aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi hazırlanır:
| Bileşenler | N servisi (25µl sistemi) |
| nCOV primer TaqMan prob karışımı | 18 µl × N |
| RT-PCR reaksiyon çözeltisi | 2 µl × N |
| *N = test edilen örnek sayısı + 1 (negatif kontrol) + 1 (nCOV)(pozitif kontrol) | |
2.2 Bileşenleri iyice karıştırdıktan sonra, tüp duvarındaki tüm sıvının tüpün dibine çökmesini sağlamak için kısa bir süre santrifüj edin ve ardından 20 µl amplifikasyon sistemini PCR tüpüne alikotlayın.
3 Örnekleme (numune hazırlama alanı)
Ekstraksiyondan sonra negatif ve pozitif kontrollerden 5 μl ekleyin. Test edilecek numunenin RNA'sı PCR reaksiyon tüpüne eklenir.
Tüpün kapağını sıkıca kapatın ve amplifikasyon algılama alanına aktarmadan önce birkaç saniye 8.000 rpm'de santrifüj edin.
4 PCR amplifikasyonu (amplifikasyonlu tespit alanı)
4.1 Reaksiyon tüpünü cihazın numune hücresine yerleştirin ve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
| sahne | Döngü sayı | Sıcaklık(°C) | Zaman | koleksiyonalan |
| Tersitranskripsiyon | 1 | 42 | 10dk | - |
| Ön denatürasyonn | 1 | 95 | 1dk | - |
| Döngü | 45 | 95 | 15 saniye | - |
| 60 | 30'lu yaşlar | veri toplama |
Enstrüman algılama kanalı seçimi: Floresan sinyali için FAM、HEX、CY5 kanalını seçin. Referans floresan HİÇBİRİ için lütfen ROX'u seçmeyin.
5 Sonuç analizi (Ayar için lütfen her bir cihazın deneysel talimatlarına bakın)
Reaksiyondan sonra sonuçları kaydedin. Analizden sonra, görüntüye göre başlangıç değerini, bitiş değerini ve baz çizgisinin eşik değerini ayarlayın (kullanıcı gerçek duruma göre ayarlayabilir, başlangıç değeri 3~15'e ayarlanabilir, bitiş değeri 5~20'ye ayarlanabilir, ayarlama) logaritmik grafikte Pencerenin eşiğinde, eşik çizgisi logaritmik fazdadır ve negatif kontrolün amplifikasyon eğrisi düz bir çizgidir veya eşik çizgisinin altındadır).
6 Kalite kontrolü (Teste prosedürel bir kontrol dahildir) Negatif kontrol: FAM, HEX, CY5 algılama kanalları için belirgin bir amplifikasyon eğrisi yok
COV pozitif kontrol: FAM ve HEX tespit kanallarının belirgin amplifikasyon eğrisi, Ct değeri ≤32, ancak CY5 kanalının amplifikasyon eğrisi yok;
Yukarıdaki şartların aynı deneyde aynı anda sağlanması gerekir; aksi takdirde deney geçersiz sayılır ve tekrarlanması gerekir.
7 Sonuçların belirlenmesi.
7.1 Test örneğinin FAM ve HEX kanallarında amplifikasyon eğrisi veya Ct değeri > 40 değilse, ancak CY5 kanalında amplifikasyon eğrisi varsa, örnekte 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) RNA'sı olmadığı sonucuna varılabilir;
.2 Test örneğinin FAM ve HEX kanallarında belirgin amplifikasyon eğrileri varsa ve Ct değeri ≤40 ise örneğin 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) açısından pozitif olduğu değerlendirilebilir.
7.3 Test örneğinin yalnızca bir FAM veya HEX kanalında belirgin bir amplifikasyon eğrisi varsa ve Ct değeri ≤40 ise ve diğer kanalda amplifikasyon eğrisi yoksa, sonuçların yeniden test edilmesi gerekir. Yeniden test sonuçları tutarlıysa, örneğin yeni için pozitif olduğu değerlendirilebilir.
koronavirüs 2019 (2019-nCoV). Tekrar test sonucu negatifse, örneğin 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) için negatif olduğu değerlendirilebilir.
Olumlu yargı değeri
Kitin referans CT değeri ROC eğrisi yöntemi ile belirlenirken iç kontrol referans değeri 40 olarak alındı.
Test sonuçlarının yorumlanması
1.Her deney negatif ve pozitif kontroller için test edilmelidir. Test sonuçları yalnızca kontroller kalite kontrol gerekliliklerini karşıladığında belirlenebilir
2. FAM ve HEX algılama kanalları pozitif olduğunda, sistem rekabeti nedeniyle CY5 kanalından (dahili kontrol kanalı) gelen sonuç negatif olabilir.
3.Dahili kontrol sonucu negatif olduğunda, test tüpünün FAM ve HEX algılama kanalları da negatifse, sistemin devre dışı olduğu veya işlemin yanlış olduğu, testin geçersiz olduğu anlamına gelir. Bu nedenle, numunelerin tekrar test edilmesi gerekir.
