Ürünler
2019-nCoV için Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR Tespit kiti
Beklenen kullanım
Bu kit, boğaz sürüntüleri, nazofaringeal sürüntüler, bronkoalveoler lavaj sıvısı, balgam kullanılarak yeni koronavirüsün (2019-nCoV) kalitatif tespiti için kullanılır. Bu ürünün tespit sonucu yalnızca klinik referans amaçlıdır ve tek test olarak kullanılmamalıdır. Klinik teşhis ve tedavi için kanıt. Hastanın klinik belirtileri ve diğer laboratuvar testleriyle birlikte durumun kapsamlı bir analizi önerilir.
Muayene prensibi
Kit, tek adımlı RT-PCR teknolojisine dayanmaktadır.Aslında 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) ORF1ab ve N genleri amplifikasyon hedef bölgeleri olarak seçildi.Spesifik primerler ve floresan problar (N gen probları FAM ile etiketlenir ve ORF1ab probları HEX ile etiketlenir) numunelerde 2019 yeni tip koronavirüs RNA'sını tespit etmek için tasarlanmıştır.Kit ayrıca numune toplama, RNA ve PCR amplifikasyonu sürecini izlemek ve böylece yanlış negatif sonuçları azaltmak için bir endojen dahili kontrol tespit sistemi (CY5 ile etiketlenmiş dahili kontrol gen probu) içerir.
Ana bileşenler
| Bileşenler | Hacim(48T/Kit） |
| RT-PCR reaksiyon çözümü | 96μl |
| nCOV primer TaqMan prob karışımı (ORF1ab, N Geni, RnaseP Geni) | 864μl |
| Negatif kontrol | 1500ul |
| nCOV Pozitif kontrol（l ORF1ab N Geni） | 1500ul |
Kendi reaktifleri: RNA ekstraksiyonu veya saflaştırma reaktifleri.Negatif/pozitif kontrol: Pozitif kontrol, hedef fragmanı içeren RNA'dır, negatif kontrol ise nükleik asit içermeyen sudur.Kullanım sırasında ekstraksiyona katılmalı ve bulaşıcı kabul edilmelidir.İlgili yönetmeliklere uygun olarak kullanılmalı ve imha edilmelidir.
Dahili referans geni insan RnaseP genidir.
Saklama koşulları ve son kullanma tarihi
-20±5°C, 6 ay boyunca geçerli olan 5 defadan fazla tekrarlanan donma ve çözülmelerden kaçının.
Uygulanabilir enstrüman
FAM / HEX / CY5 ve diğer çok kanallı floresan PCR cihazı ile.
Numune gereksinimleri
1. Uygulanabilir numune türleri: boğaz sürüntüleri, nazofaringeal sürüntüler, bronkoalveoler lavaj sıvısı, balgam.
2.Numune toplama (aseptik teknik)
Faringeal swab: Bademcikleri ve faringeal arka duvarı aynı anda iki swab ile silin, ardından swab başlığını numune alma solüsyonunu içeren bir test tüpüne batırın
Balgam: Hastanın derin öksürüğü başladıktan sonra, öksürük balgamını numune alma solüsyonunu içeren vidalı kapaklı bir test tüpüne toplayın;bronkoalveoler lavaj sıvısı: Tıp uzmanları tarafından numune alma.3. Numunelerin saklanması ve taşınması
Virüs izolasyonu ve RNA testi için örnekler mümkün olan en kısa sürede test edilmelidir.24 saat içinde tespit edilebilecek örnekler 4°C'de saklanabilir;24 içinde tespit edilemeyenler
saat -70°C veya altında saklanmalıdır (-70°C saklama koşulu yoksa,
geçici olarak -20°C buzdolabında saklanır).Numuneler taşıma sırasında tekrarlanan donma ve çözülmelerden kaçınmalıdır.Örnekler alındıktan sonra mümkün olan en kısa sürede laboratuvara gönderilmelidir.Numunelerin uzun mesafelere taşınması gerekiyorsa kuru buz depolaması önerilir.
Test yöntemleri
1 Örnek işleme ve RNA ekstraksiyonu (örnek işleme alanı)
RNA ekstraksiyonu için 200μl sıvı numune alınması tavsiye edilir.İlgili ekstraksiyon adımları için ticari RNA ekstraksiyon kitlerinin talimatlarına bakın.Hem olumsuz, hem olumsuz
Bu kitteki kontroller ekstraksiyona dahil edildi.
2 PCR reaktif hazırlama (reaktif hazırlama alanı)
2.1 Kitin tüm bileşenlerini çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürüp karıştırın.Kullanmadan önce birkaç saniye 8.000 rpm'de santrifüjleyin;Gerekli reaktif miktarını hesaplayın ve reaksiyon sistemi aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi hazırlanır:
| Bileşenler | N porsiyon (25μl sistem) |
| nCOV primer TaqMan prob karışımı | 18 ul × N |
| RT-PCR reaksiyon çözümü | 2 ul × N |
| *N = test edilen numune sayısı + 1 (negatif kontrol) + 1 (nCOV)pozitif kontrol) | |
2.2 Bileşenleri iyice karıştırdıktan sonra, tüp duvarındaki tüm sıvının tüpün dibine düşmesini sağlamak için kısa bir süre santrifüjleyin ve ardından 20 µl amplifikasyon sistemini PCR tüpüne bölün.
3 Numune alma (numune hazırlama alanı)
Ekstraksiyondan sonra negatif ve pozitif kontrollerden 5μl ekleyin.Test edilecek örneğin RNA'sı PCR reaksiyon tüpüne eklenir.
Tüpün kapağını sıkıca kapatın ve amplifikasyon tespit alanına aktarmadan önce birkaç saniye 8.000 rpm'de santrifüjleyin.
4 PCR amplifikasyonu (güçlendirilmiş tespit alanı)
4.1 Reaksiyon tüpünü cihazın numune hücresine yerleştirin ve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
| sahne | Döngü sayı | Sıcaklık(°C) | Zaman | Toplamakalan |
| Tersitranskripsiyon | 1 | 42 | 10 dk | - |
| Ön denatürasyonn | 1 | 95 | 1 dakika | - |
| Döngü | 45 | 95 | 15'ler | - |
| 60 | 30'lar | Veri toplama |
Cihaz algılama kanalı seçimi: Floresan sinyali için FAM、HEX、CY5 kanalını seçin.Referans floresan YOK için lütfen ROX'u seçmeyin.
5 Sonuç analizi (Ayar için lütfen her cihazın deneysel talimatlarına bakın)
Reaksiyondan sonra sonuçları kaydedin.Analizden sonra, görüntüye göre taban çizgisinin başlangıç değerini, bitiş değerini ve eşik değerini ayarlayın (kullanıcı fiili duruma göre ayarlayabilir, başlangıç değeri 3~15 olarak ayarlanabilir, bitiş değeri şu şekilde ayarlanabilir: Logaritmik grafikte 5~20, ayarlama) Pencerenin eşiğinde, eşik çizgisi logaritmik fazdadır ve negatif kontrolün amplifikasyon eğrisi düz bir çizgidir veya eşik çizgisinin altındadır).
6 Kalite kontrolü (testte bir prosedür kontrolü bulunur) Negatif kontrol: FAM, HEX, CY5 tespit kanalları için belirgin amplifikasyon eğrisi yok
COV pozitif kontrolü: FAM ve HEX tespit kanallarının belirgin amplifikasyon eğrisi, Ct değeri≤32, ancak CY5 kanalının amplifikasyon eğrisi yok;
Yukarıdaki gereklilikler aynı deneyde eş zamanlı olarak karşılanmalıdır;aksi takdirde deney geçersizdir ve tekrarlanması gerekir.
7 Sonuçların belirlenmesi.
7.1 Test örneğinin FAM ve HEX kanallarında amplifikasyon eğrisi yoksa veya Ct değeri> 40 ise ve CY5 kanalında amplifikasyon eğrisi varsa 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) olmadığı yargısına varılabilir. Örnekteki RNA;
.2 Test numunesinin FAM ve HEX kanallarında belirgin amplifikasyon eğrileri varsa ve Ct değeri ≤40 ise numunenin 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) için pozitif olduğu yargısına varılabilir.
7.3 Test örneğinin yalnızca FAM veya HEX kanalında net bir amplifikasyon eğrisi varsa ve Ct değeri ≤40 ise ve diğer kanalda amplifikasyon eğrisi yoksa sonuçların yeniden test edilmesi gerekir.Yeniden test sonuçları tutarlıysa numunenin yeni test için pozitif olduğu kararına varılabilir.
koronavirüs 2019 (2019-nCoV).Tekrar test sonucunun negatif olması durumunda numunenin 2019 yeni koronavirüs (2019-nCoV) açısından negatif olduğu yargısına varılabilir.
Olumlu karar değeri
Kitin referans CT değerini belirlemek için ROC eğrisi yöntemi kullanılır ve dahili kontrol referans değeri 40'tır.
Test sonuçlarının yorumlanması
1. Her deney negatif ve pozitif kontroller açısından test edilmelidir.Test sonuçları yalnızca kontrollerin kalite kontrol gerekliliklerini karşılaması durumunda belirlenebilir
2.FAM ve HEX algılama kanalları pozitif olduğunda, CY5 kanalından (dahili kontrol kanalı) gelen sonuç sistem rekabeti nedeniyle negatif olabilir.
3.Dahili kontrol sonucu negatif olduğunda, test tüpünün FAM ve HEX algılama kanalları da negatifse bu, sistemin devre dışı olduğu veya işlemin yanlış olduğu anlamına gelir, test geçersizdir.Bu nedenle numunelerin tekrar test edilmesi gerekmektedir.
